Bildgebende Raman-Spektroskopie

Bei der bildgebenden Raman-Spektroskopie wird die Probe wie ein Digitalbild Pixel für Pixel abgerastert und an jeder Stelle ein Raman-Spektrum gemessen. Typisch sind Messungen mit 50 x 50 (=2500) bis 250 x 250 (=62500) Pixeln beziehungsweise Raman-Spektren. 

Die Software speichert jedes einzelne Spektrum und die dazugehörige Position. Nach der Messung werden alle Spektren miteinander verglichen und ausgewertet. Im ersten Schritt werden die Basisspektren aller Inhaltsstoffe ermittelt. Dazu gibt es mathematische Verfahren wie die Principle Component Analyse, Cluster Analyse oder Weighed Selection Analyse.

Diese „reinen“ Basisspektren, die für je einen Inhaltsstoff stehen, werden im zweiten Schritt mit den gemessenen Daten verglichen. Mathematisch wird jedes gemessene Spektrum als Linearkombination der Basisspektren dagestellt. Als Ergebnis erhält man für jedes Basisspektrum (jeden Inhaltsstoff) eine Matrix mit einem Wichtungsfaktor je Zelle beziehungsweise für jedes gemessenen Spektrum. Jeder Matrix (resp. Inhaltsstoff) wird nun eine Farbe zugeordnet und der Wichtungsfaktor als Helligkeitswert festgelegt. Durch Übereinanderlegen der farbkodierten Bilder werden die Informationen verknüpft und das Raman-Bild entsteht. Hierbei können Strukturen voneinander abgegrenzt oder Mischungen festgestellt werden, denn Mischfarben entsprechen Mischspektren.

Das folgende Beispiel verdeutlicht die Bildentstehung anhand einer Probe mit 3 Komponenten anhand von 24 x 18 Pixeln über 4 x 3 µm.

Das Messen eines einzelnen Raman-Spektrums von einem Stoff ist heutzutage nicht sonderlich schwierig. Benötigt werden ein Laser, ein Spektrometer, zwei spezielle Filter und eine Optik zum Fokussieren in die Probe. Die Ansprüche an die Komponenten sind nicht besonders hoch, denn bei einem einzelnen Spektrum ist die Messzeit von mehreren Sekunden kein Problem, da von vorne herein nur wenige Spektren gemessen werden. Die Bestückungs- und Vorbereitungszeit übertrifft die Messzeit bei weitem.

Wie eingangs beschrieben, werden bei der bildgebenden Raman-Spektroskopie aber eher 2500 bis 62500 Spektren gemessen. Wenn jedes Spektrum eine Messzeit von 1 Sekunde benötigt, dauern diese Messungen zwischen 40 Minuten und 17 Stunden. In der Praxis sind solche Messzeiten kaum zumutbar, geschweige praktikabel. Gerade bei langen Messzeiten muss das Gerät besonders hinsichtlich Temperatur stabilisiert sein, um die Messabweichungen gering zu halten. Aus diesem Grund verwendet Optoneer ein Forschungsmikroskop der Spitzenklasse, mit dem Integrationszeiten von < 100 ms bei Einzelmessungen möglich sind. So entstehen Raman-Bilder innerhalb weniger Minuten bis wenige Stunden.

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